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无醛混合固定液与甲醛固定液对大鼠器官组织检材形态学保存效果的比较研究

  

摘要目的探讨两种自制无醛混合固定液对大鼠组织检材的形态学保存效果。方法采用动物实验,不同类型的组织分组处理,分别用三种固定液进行固定后,行常规脱水、包埋、染色、封片处理,镜下观察,对形态学效果进行评分,并分析。结果对大鼠肝组织、胃组织的形态学保存效果,4%中性甲醛固定液组与A固定液组、B固定液组得分比较差异无统计学意义(P>0.05);对大鼠肺组织、脑组织的形态学保存效果,4%中性甲醛固定液组与A固定液组得分比较差异无统计学意义(P>0.05),但与B固定液组得分比较差异有统计学意义(P<0.05)。结论固定液A对大鼠组织病理学检材的形态学保存效果不亚于甲醛固定液,且具有无毒、无刺激性气味等特性,可尝试应用于病理实验室检验流程。

关键词无醛混合固定液甲醛固定液病理检材形态学保存效果

组织固定是病理学检验工作中的重要步骤,组织检材经固定后方可进行后续的检验操作,固定是否成功直接决定了其形态学保存效果,进而影响最终的病理学诊断,在临床医学中可直接影响患者如肿瘤、结核等疾病的判定,在法医学中则可参与死因的分析判断过程。4%中性甲醛作为一种被广泛认可的固定液,一直应用于临床病理学检验及法医病理学检验的组织固定环节。但甲醛的使用对人体与环境均有一定毒害作用,因此,使用无醛液替代甲醛固定液应用于医学实践具有重要意义。本研究以自制的两类无醛混合固定液为研究对象,通过动物实验观察其对大鼠组织检材形态学保存效果,并与甲醛固定液进行对比分析,以探讨其应用价值。

1材料与方法

1.1材料实验

用大鼠50;4%中性甲醛固定液;无醛混合固定液:A固定液:以乙醇为主体溶剂,含丙三醇、聚乙二醇、冰醋酸等;B固定液:以乙醇为主体溶剂,含冰醋酸、亚硝酸钠等。

1.2方法

将实验动物处死后,立即对所有大鼠肝、肺、脑、胃四个部位的组织分别进行器官取材,每个部位的取材数量相等。将不同部位的所有组织检材均分为3,分别置于4%中性甲醛固定液、A固定液、B固定液中固定24h,期间(12h)更换1次固定液。取出组织检材后,按照操作标准分别取1cm×0.5cm×0.2cm大小的组织块(胃组织取1cm×0.2cm的条状),放入包埋盒后再经同一固定液继续固定4h。按动物组织设定仪器程序,行常规脱水、包埋处理,每组各取40个蜡块,120个蜡块,再经切片、漂片、染色、封片处理。

1.3形态学保存效果判定

2位有病理学专业背景且具有中级职称以上的专业人员采用双盲法对切片进行镜下观察,并对切片作出评分。评分标准:5,切片形态完整、无明显厚薄差异,细胞内各成分着色鲜艳对比清晰,满足病理诊断需要;4,切片形态完整、无明显厚薄差异,存在少许褶皱,核质红蓝对比清晰,基本满足病理诊断需要;3,切片形态基本完整、无明显厚薄差异,有褶皱及刀痕,核质可见红蓝对比,对病理诊断存在一定影响;2,切片形态基本完整,厚薄差异明显,有褶皱、刀痕等,核质红蓝对比差,严重影响病理诊断;1,切片形态不完整,褶皱、刀痕明显,甚至出现空泡,无法进行病理诊断。按计分分值分为优秀、良好、中等、较差、不合格5个等级。

1.4统计学方法

使用SPSS17.0统计学软件对数据进行分析,计量资料以x±s表示,采用方差分析,P<0.05为差异有统计学意义。

2结果

肝组织HE染色:4%中性甲醛固定液组与A固定液组、B固定液组得分比较差异无统计学意义(P>0.05)。肺组织HE染色:4%中性甲醛固定液组与A固定液组得分比较差异无统计学意义(P>0.05);但均高于B固定液组,得分比较差异有统计学意义(P<0.05)。脑组织HE染色:4%中性甲醛固定液组与A固定液组得分比较差异无统计学意义(P>0.05);但均高于B固定液组,得分比较差异有统计学意义(P<0.05)。胃组织HE染色:4%中性甲醛固定液组与B固定液组得分略高于A固定液,但差异无统计学意义(P>0.05)。见表1~3

3讨论

甲醛固定组织的主要作用机制是醛基与氨基基团形成可逆的羟甲基衍生物和稳定的亚甲基桥,从而使甲醛和蛋白质发生广泛的交联,可能使甲醛改变许多生物分子,包括核酸和蛋白质[1]。与甲醛不同,以乙醇为基础的固定液固定机制主要是通过去除组织内的自由水,破坏水分子与蛋白质之间维持蛋白质的三级结构的疏水键从而使蛋白质分子变性,但仍然维持其二级结构的构象和功能[2]。通常而言,好的固定液能在不破坏细胞原有形态的情况下,以最快的速度达到最理想的固定效果[3]。以乙醇为主体溶剂的无醛混合固定液种类丰富,在国内外不乏已研制出诸多此类环保型的固定液,甚至在国外发达国家,已经推广应用环保型的固定液取代甲醛固定液[4]。根据相关报道和笔者所了解的情况,国内很多医院及研究机构的病理检验研究部门也已在逐步推广使用以GS无醛固定液为代表的新型环保固定试剂,但就开展法医病理鉴定的公安机关及社会司法鉴定机构而言,甲醛仍是其使用最多、应用最广的固定试剂,且整体的用量较大。长期接触甲醛可对人体造成损害,如皮肤黏膜的刺激、引起结膜炎等,且具有高度的致癌风险。同时,甲醛作为病理组织检材的固定液也有其弊端,如长时间固定易出现问题甚至影响病理诊断、废液处理不当容易造成生态环境污染等。本研究结果表明:基于乙醇为主体溶剂、含丙三醇、聚乙二醇、冰醋酸等的无醛混合A固定液对大鼠肝、肺、脑、胃组织的形态学保存效果方面不亚于4%中性甲醛固定液(P>0.05);基于乙醇为主体溶剂、含冰醋酸、亚硝酸钠等的无醛混合B固定液对大鼠肝、胃组织的形态学保存效果不亚于4%中性甲醛固定液及A固定液(P>0.05),但对大鼠肺、脑组织的形态学保存效果不及4%中性甲醛固定液及A固定液,甚至有较大差距(P<0.05)。分析原因,主要差别在于冰醋酸的比例以及丙三醇、聚乙二醇、亚硝酸钠的化学作用。冰醋酸及丙三醇对于细胞核着色及着色的鲜艳程度有促进作用,而聚乙二醇增强了固定液对细胞组织的穿透性。

肺、脑组织的保存效果较差除试剂本身的原因外,与组织器官的致密性等也有关联,此外,还可能是固定液与组织内的成分发生了化学反应的结果。综上所述,以乙醇为主体溶剂,含丙三醇、聚乙二醇、冰醋酸等的固定液A在组织检材的形态学保存效果上不亚于4%中性甲醛固定液,且具备无毒、无刺激性异味等特点,同时成本比较低廉,故可以尝试用于病理实验室检验流程。而在法医病理学检验过程中对于解剖过程中提取的人体较大组织器官固定的保存效果、以及医学院校中对于人体大型器官标本长期固定的保存效果均有赖于结合实践进一步研究。此外,随着DNA技术的发展,很多检验研究方面对于经固定液保存过的组织检材再应用于DNA测序提出了高要求,如对甲醛固定组织运用实时荧光定量反转录聚合酶链反应技术分析各RNA指标的扩增效率及相对表达量等[5],可作为后续研究的重点内容。

参考文献

[1]陈志强,王莹,米贤军,.聚羟基丙烯酸和4%中性缓冲甲醛对苏木精伊红染色及荧光原位杂交检测乳腺癌HER-2基因影响的比较[J].中国癌症杂志,2016,26(2):121-127.

[2]吴平.不同组分固定液对组织保存效果影响的研究[D].福建医科大学,2014.

[3]黄荣祥,余岚岚,朱晨雁.无醛固定液与醛类固定液对细胞核DNA及细胞质着色的影响[J].重庆医学,2017,46(23):3241-3244.

[4]潘黎明.环保型无醛固定液与甲醛固定液对免疫组化染色的效果比较[J].现代实用医学,2013(5):583-584.

[5]LüYH,LISY,LIZH.QuantitativeExpressionofRNAfromFrozenOrgansandFormaldehyde-fixedandParaffin-embeddedTissues[J].FaYiXueZaZhi,2019(4):387-392.

 

 

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